每年的热天伏季,池塘养殖水体最容易出现各种水质问题,特别是暴发蓝藻和铁锈水(也称为”水锈”)的状况,这两种现象基本上是年年有年年也在谈,成了每年都要出现和发生的难题,让人们非常苦恼。本文就”水锈”作一简单介绍,仅供参考和探讨。

人类的主要睡眠是快速眼动和慢波睡眠。这种睡眠很容易地通过神经和肌肉模式识别,哺乳动物、鸟类、蜥蜴动物中比较常见。但是海洋和湖泊里的鱼类需不需要睡眠?怎么睡眠呢?

转基因鱼是生物技术的成果生物技术是一项以生命科学为基础,利用生物体系和工程原理生产生物制品和创造新物种的综合性科学技术。又称生物工程。主要包括基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程四个领域。基因工程是现代生物技术的核心,它在生物技术中占有重要的地位和起着重要作用。所谓基因工程,是指人们利用分子生物学技术手段,操纵、改造和重建细胞的基因组,从而使生物体的遗性状发生定向变异。而转基因动植物则是传统基因工程的进一步发展,也是基因工程这一科学技术发展的必然趋势。基因转移技术具有为人类造福的巨大潜力,首先受益的是医药卫生和保健事业,如基因工程药物的开发、遗传病的基因诊断和遗传保健以及基因治疗等,给医学带来划时代的变革。另外,从20世纪80年代后期开始,在农业、畜牧业和水产养殖业中,也逐渐引进了基因转移技术,出现了高产、优质、抗虫和抗病的转基因植物和转基因动物品系,显露出农牧渔业高科技革命的曙光,这再一次表明基因工程技术在科学技术研究中有着重要的地位和作用。

一、“水锈”概念

研究人员Philippe
Mourain等研究发现斑马鱼幼虫睡眠的神经特征571198-204)。研究人员通过睡眠和静止的鱼苗,记录大脑活动、心率、眼球运动和肌肉张力。结果发现鱼类也有数种睡眠,包括广泛的沉默以及两种状态,称为“慢爆发睡眠”和“传播波睡眠”。这是类似慢波睡眠和快速眼动睡眠。

基因转移以来,转基因动物的研究方兴未艾。动物基因工程研究最突出的方面便是转基因鱼的诞生。转基因鱼的研究作为转基因动物研究领域的一部分,虽然稍晚于哺乳类,但由于鱼类基因工程育种本身具有的潜在经济价值和作为转基因研究缩聚有的有利条件而取得重大进展。转基因鱼是目前国内外获得最成功的转基因动物之一。

“水锈”也可称为“锈水”是个较为广泛的概念,简而言之意为生锈的水,也是”水华”的表现,泛指养殖水体表面有一层铁锈色或者淡绿色的浮层油膜,也就是说”水生锈了”似的,故名“水锈”或”锈水”。通常是指水体表面生成油膜泡沫,颜色大多呈铁锈色为主(甲藻为主),也有蓝色浮膜现象(裸藻为主),这种水体除了甲藻、裸藻、裸甲藻等等藻类外,可能还含有铁化物以及大量的铁离子重金属等物质。另外,凡是出现”水锈”水色,它是一个警戒水质的信号,应加倍小心应对,提早改良为宜。

与人类快速眼动睡眠一样,斑马鱼的睡眠也受到黑色素浓缩激素的控制许多鱼类、两栖动物和爬行动物在睡觉时会为了伪装而改变肤色,可能与观察到这种与色素有关的激素在睡眠调节中发挥作用有关。

国内转基因鱼研究概况

二、“水锈”流行时节

睡鱼的生理状态也和我们很相似。失去肌肉张力,心跳下降,对刺激没有反应。这种神经机制的进化推回到我们时代之前的4.5亿年。墨西哥淡水鱼种的分离种群在不同的环境中有很大的差异。洞穴居住的居民,也失去了视力和色素沉着,已经把他们的睡眠时间减少到每天1到2小时,而在地表水的居民睡眠6到8小时。而对于其他动物睡眠时间,从马的3小时以下到负鼠的19小时以上。

动物基因工程是20世纪70年代开展起来的一项遗传育种新技术。我国学者朱作言率先提出了鱼类转基因研究。由于鱼类具有它自身的有利条件,如属较低等的脊椎动物、可对多种高等脊椎动物的生长激素作出反应,因此继1985年第一批转基因鱼在中国问世以后,世界上许多国家相继开展了鱼类转基因研究。在短短几年中,取得了很大的成绩。我国是水产大国,而且又有鱼类核移植的良好基础,在许多单位开展了鱼类转基因研究,并取得较好成绩。下面把我国一些学者进行的鱼类转基因工作作一简介。

水锈,大多发生在春夏和夏秋交接季节,以夏秋两季高热时节为主,只要气温在20℃以上时即有可能发生,但集中暴发期是温度30℃以上并且太阳光照很强时最为发生。水锈主要分两种状况:铁锈色水和蓝色浮膜水,以铁锈色水为多见。鱼塘的水面上出现一片红色或有时又是翠绿的薄层,有时还发出一股难闻的腥味,这就是人们所说的”水锈”或”铜锈水”或”铁锈水”。

这些对鱼类睡眠的研究可以帮助我们了解睡眠,另外阐明如何根据不同的持续时间来校准睡眠量的稳态调节。

1.朱作言等首先进行鱼类转基因研究,采用显微注射方法,把小鼠重金属结合蛋白基因启动顺序与人生长激素基因序列的重组DAN片段,注入鲤鱼、鲫鱼和泥鳅的受精卵。该研究证明了外源基因可以通过生殖细胞传递给后代,并显示出不同程度的快速生长效应。该研究首次建立了一个高效、简洁而且完整的转基因鱼模型,它为鱼类基因工程定向育种新技术奠定了实验基础。同时该研究就鱼类基因转移和育种的一系列问题进行了深入探讨,为进一步开展鱼类转基因研究打下了基础。但实验表明,hGH基因不是理想的目的基因,再加之生物安全和人们的观念问题,朱作言又成功的克隆了鲤鱼和草鱼的肌动蛋白基因,并获得了具有调节功能的肌动蛋白基因启动子,和草鱼的生长激素基因组合成全鱼基因,导入鲤鱼和银鲫,先将进入中试阶段。朱作言等的一系列研究促进了鱼类转基因研究的发展。

三、“水锈”的辨识

2.吴婷婷和夏德全等采用显微注射方法,将带有小鼠重金属结合蛋白基因启动子与人生长激素基因序列重组的线状DNA
片段,注入团头鲂和鲤的受精卵,获得成活的实验鱼。经斑点杂交,Southern杂交、Northern杂交、放射免疫和酶联等方法检测,表明外源基因在受体鱼中得到整合、转录和表达,并具有促生长效应。转基因雌鱼和雄鱼有性繁殖所获得的子代带有外源基因,表明外源基因能通过性细胞传给子代,并仍具促生长效应。

铁锈色水以甲藻为主,蓝色浮膜水以裸藻为主,铁锈水甚至还有铁离子等重金属超标所致的类型。可用显微镜据实查验:在显微镜下,如果水样中甲藻、裸藻、裸甲藻等或各占优势,说明导致锈水的成因是不同藻类的过度繁殖所致。

3.孙效文等用显微注射方法,把牛、羊生长激素基因注入黑龙江野鲤、荷包红鲤抗寒品系和德国镜鲤等受精卵,孵化后得到143尾转基因鱼。他们的研究确立外源基因注射到鲤鱼受精卵的最佳注射时间为鲤鱼受精卵发育的单细胞后期。他们又进行了全鱼基因克隆,构建了鲤鱼小鼠重金属结合蛋白基因启动子和大麻哈鱼生长激素基因重组的全鱼生长激素基因,在鲤鱼上进行转基因试验,而且他们正在把转基因鲤鱼投入中试。

(甲藻)

国内鱼类转基因研究蓬勃发展。除了上述研究外,还有很多鱼类转基因研究的报道。他们用人生长激素基因作外源基因进行转基因研究。也有用牛生长激素基因和羊生长激素的。还有一些实验室克隆了大麻哈鱼和虹鳟的生长激素基因。除此以外,还克隆了抗冬蛋白基因。综上所述,我国进行转基因鱼研究的单位多,人员广,并取得了很大成绩,对鱼类转基因研究作出了重大贡献。

(裸藻)

转基因鱼构建构建转基因鱼是一个复杂而科技含量较高的技术,主要包括以下几个方面:

如果都不是,就说明是养殖水体中可能铁含量超标造成的。铁含量超标引发的铁锈水通常发生在抽取地下水做水源,池塘底部有水渗出或者靠近海边的红树林地带。

1.目的基因的获得

四、“水锈”对养殖的危害

首先从基因文库中得到一个含侧翼调控序列的合适的目的基因。侧翼调控序列包括位于基因编码序列上游的启动子及位于编码序列上游和下游的组织特异性增强子。

在水体表面形成的浮层油膜阻碍了其以下的水体接受到光照的照射,阻碍光合作用的进行,同时浮层油膜的存在也影响水体及鱼和空气的接触,导致水体溶氧的降低。表层藻类大量死亡后产生的藻毒素也对水生动物发生毒害作用,可能导致水生动物厌食,生长缓慢甚至水质恶化乃至患病。”水锈”水质稳定性不高,容易发生大规模的倒藻。因此需要从水质管理的角度对这种池塘水质进行调节,促使池塘藻相多样化。

2.基因克隆

(甲藻)

获得的基因序列必须克隆到质粒或噬菌体中,并在合适的菌种中扩增。然后从培养的细菌中提取这种质粒或噬菌体DNA,用合适的限制性内切酶酶切分离出插入载体的外源基因序列。通过电泳分析,确定分离的DNA片段的分子量,以证实所分离的序列是我们所需的基因片段。

“水锈”大多是由水中裸(红)甲藻或者其它甲藻类生物滋生所致,但也有其它原因比如加注的地下水中含铁、含硝成份很高时也会促成。从理论上说,如果鱼类吃了这些藻类后,轻者难于消化,影响生长,重者则会造成鱼类大量死亡,但现实中很少发现有鱼儿吃食这些藻类,可能是裸甲藻类不适于鱼的口味所致。因此,在春、夏、秋三季,应该尽量做好对锈水的预防和清除工作。

3.受体鱼的获得

五、“锈水”短暂变化特殊情况的处理

在鱼类繁殖季节,选取成熟的雌、雄鱼,注射垂体或激素催产,分别收集精液和卵子,干法受精。受精卵去膜,将裸卵移至Holtfreter
溶液中,选取质好的裸卵移质手术杯中作基因转移。

有时因气候原因或水质变化因素在短时间内(比如一、两天之内短暂发生或者上午出现下午消失)短暂出现”水锈”,持续一定时间后又消失,其后完全恢复为正常状态,可以忽略不予处理,也不必调理。(见下图例),因为水体是一个自身自然循环的水生态系统,在一定情况下具有和启动自我调节、自我修复的功能。

4。注射基因

(2019年8月17日上午9时许出现”水锈”)

目前有几种将外源基因导入鱼卵的方法:显微注射法、电穿孔法、精子载体法和基因枪法。

(2019年8月17日午后1时许”水锈”消失)

5.不论用何种方法注射了DNA的鱼卵,其处理方法与通常一样。

短暂出现”水锈”主张忽略并不予调理的方法,这是水体自身的调控和修复功能在起作用,其目的是尽量维持水生态系统的自然循环状态,尽量不投入或少投用药物入塘,因为”是药三分毒”,有些药物入水后还有可能”按下葫芦起了瓢”,引起后续的一系列水生态未知结果的变化,有利有弊。但是,如果反复并持续不间断出现”水锈”,表明水体到了非治不可的程度,就需施药改良水质。

必须保留与注射DNA的鱼卵同一批次的鱼卵作为对照,以便比较转基因实验各步骤中的成活率。

短暂出现”水锈”时应先行注意细察是否有恶化的趋势,有时水体在一定的(短)时间后会自动恢复正常状态,有时也会继续恶化下去并有腥味的发生,即可施治,不要动不动就大量投用药物和生物制剂,任何调水、改水的东西虽然有利但也有弊,某种情况下可能反而会破坏水体的自然生态系统,适得其反。

鱼卵孵化后,需考虑的问题是,杀死部分幼鱼作为提取DNA的样品用于转基因的检测,还是等幼鱼长大后进行活体采样用于检测。大多数实验室同时采用上述两种方法。

六、因藻类形成”水锈”及其防控方法

区别完全的转基因鱼与嵌合体转基因鱼

1.底质恶化

如果外源基因在受精卵分裂后某阶段才整合入受体基因组中,则肯定那些从整合了外源基因的细胞发育而来的组织才含有外源基因序列。这种仅在部分组织中整合有外源基因的动物称为嵌合体。

很多养殖池塘多年不清淤,池底淤泥厚,甚者超过40公分以上,积累了大量的有机质,或者塘底不洁,一到天气暴热时节,底质发热导致底层物质泛起,导致甲藻、裸藻及其裸甲藻暴发,或者养殖水体底泥中富含铁分子等重金属物质,也会随着底质的渗出进入到养殖水体,造成养殖水体中的铁超标。

转基因鱼的应用潜力

在养殖过程中,由于气温持续高热,水体上下分层,水温不均,白天表面热水和下面的冷水对流困难,到夜晚表层水散热量速度快,渐渐地池底水温高于地面,水体上下对流开始,多数情况下是在早上太阳光出现时,大量污秽物质随着底热致底层水上浮,有时也和池鱼分泌的粘液集合在一起生成油膜泡沫。等中午之后,水体光合作用产氧增多,水中有益藻类可以利用或分解一部分有机物或其它藻类,这样到了下午太阳落时,多数情况下只有下风口或池角有少量的油膜泡沫。

  1. 快速育种

(甲藻)

传统的品种选育需经过多代反复选种交配才能育成优良品种。转基因技术有可能在很短时间内超越自然界亿万年生物进化历程,创造自然界原来没有的品种或品系,这是常规育种难以办到的,故此引诱力极强。

一般情况下,有大风时油膜泡沫少,小风和无风时油膜泡沫多的特点。像这种铁锈水上午多,下午少的水质一般是由于“底质恶化”引起的。

  1. 改良养殖性能

(裸藻结构图)

如加快受体的生长、提高饵料利用率及抗逆性等。不少实验表明,转基因鱼生长速度可提高11%-30%,即所谓“超级鱼”。但这些结果多为实验室环境所得,尚待养殖生产环境的检验。有的转基因鱼可提高饵料利用率,有的则表现出耐寒或耐热、耐低盐度或高盐度、耐高浓度重金属、耐污染物以及乃缺氧等,产生乃逆性较强的鱼。

2.养殖水体中甲藻裸藻的过度繁殖

  1. 生产医药生物制品

水体中因甲藻、裸藻以及裸甲藻等藻类的过度繁殖旺盛,导致水体的表层或者整个水体呈红褐色或呈蓝绿色油膜浮层,俗称“铁锈色”或“锈水”,漂去表层浮物却见表层以下水体水质清瘦,此处是与蓝藻最大的区别之处,水表层富有锈色油膜,有黏性,以变形裸藻和血红裸藻为优势种,趋光性强,常呈红色或褐红色,多出现于在春夏之交或夏秋之交时节,形成后水面覆盖率可达30%-100%,此外还常有“晴红阴绿”、“昼红夜绿”、“朝红夕绿”等等的变化。

通过转基因鱼生产生物活性物质以满足医药需要,生产对外外来物质成阳性的反应器的鱼以满足医疗的需要,研制携带人类胰岛素的转基因鱼以提供胰岛素的研究也开始引起了人们的重视。

3.防控方法

以上均是常规育种难以办到的特定性状的定向选育,是渔业科技工作者梦寐以求达到的。

(1)有水源条件的加水、换水当然最好,用底净类药物沉底改底,开启增氧机,能起到较好的改善作用。

转基因鱼应用存在问题10多年来,转基因鱼研究虽有很大进展,但进展并不如人意。虽然我国有两种转GH鲤已投入生物安全性评价研究,但国内外至今尚无商业性生产的事例,虽有个别宣传性报道说,转基因鲑在苏格兰和爱尔兰已大量生产,在美国已开始养殖,但未见有科学报道。

(2)按每亩水深1米用生石灰10-20公斤,将生石灰溶化兑水成浆,泼洒全池,调节水体pH值,因甲藻和裸藻类喜酸怕碱。

  1. 外源基因在受体鱼中的定点整合

(3)按每立方米水体用硫酸铜0.7-1克调成溶液,泼洒全池,对”锈水”均有较好的防止和清除效果,但要开机增氧。

目前所能导入的基因尚属随机,目的基因和基因定点尚不能预先精确设定,整合率和表达率低。

(4)使用灭藻类药物(包括硫氰酸红霉素、蓝藻分解剂、二氧化氯、氯杀灵等)全池或局部泼洒。用硫氰酸红霉素+粗盐(单用红霉素亦有效,杀灭蓝、绿藻亦有效)进行泼洒。

  1. 外源基因在受体鱼中的可控表达

(5)使用絮凝、络合剂(比如硫代硫酸钠、聚合氯化铝、络合铜等)等药物。

由于导入的基因属随机,在各受体中整合的量及部位不同,又缺少调控手段,外源基因在受体鱼中的表达也是随机的。产出的转基因鱼畸形众多;特别是在转基因鱼的后代中,各仔鱼具有的外源基因拷贝数不一样,发生分离,优良性状不能稳定。

(6)藻类形成的红水在发生初期,可用1克/立方米的 (30%)漂白粉或0.35克/立方米
(30%)三氯异氰尿酸粉化水遍洒杀灭控制;发生后期,每天换水1/10,连换5天,注意每天增氧,注意加入新水要有较好的藻相。

3.转基因鱼的培育与繁殖

(7)视情况杀灭部分藻类然后解毒重新培藻。整个过程中须注意增氧。在池塘下风口处可用硫酸铜或者强氯精等等杀藻药物在下风处泼洒,杀灭部分藻类。间隔一天向池塘中冲注新水并立即用磷肥或者磷酸二氢钾(0.5-1.5公斤/亩)全池泼洒,可以促进其它藻类生长。

搞出几条转基因鱼已非难事,但转基因鱼的正常生长、成熟及繁殖,所转移的基因在后代中有效地遗传及建立起有效的繁育群体等,是今后应着重解决的切实问题。

(8)调节盐度。裸藻大部分喜生长在淡水中,可以泼洒粗盐进行抑制。

4.转基因鱼应用的安全问题

(9)施用市售专用药物。

转基因鱼释放的安全问题已受到各国政府和人民的广泛关注。证实转基因鱼应用的安全性,是转基因鱼商品化的前提。

注意:不论使用什么药物调理,都得加开增氧机进行增氧操作,防止夜间缺氧。另外,由于”锈水”藻类都具有很强的趋光性,基本都集中在水体的中上层,杀藻药物的用量可以按50厘米水深计算即可。

不解决这些问题,用转基因技术培育人们所期待的优良品种和生物制品、尤其是它们的商业化生产及安全使用就难以实现。

七、水中重金属含量过高引起的”水锈”

如果养殖水体底泥中的铁含量超标,随着底质的渗出进入到养殖水体中,会造成养殖水体中的铁超标。另外,使用地下水作为水源水,如果地下水中的铁、硝等物质超标,这种情况通常可以见到池塘的进水管道发红或者发黄。水中的铁化合物和金属离子含量比较重,加了井水之后,不久,因为水体重金属超标,池塘里的水质也会变为锈色水。

水体中的铁含量超标时,不单是水表层显现红色,甚至可能整个水体都呈”红水”状态,这个现象可以和一般的”水锈”加以区别。

养殖水体中的重金属超标的危害

导致鱼虾慢性中毒,生理机能受影响,对呼吸器官产生腐蚀,影响水生动物的呼吸和摄食,生长缓慢等。由于养殖水体中的重金属超标,导致水体的藻类很难生长起来,肥水困难。

防控方法

使用络合药物沉降水中过多的重金属离子,比如使用硫代硫酸钠药物、聚合氯化铝,还可以使用腐殖酸钠,EDTA
等,其中EDTA在养殖水体中的使用成本较高,目前在育苗水体中使用得较为广泛。腐殖酸钠,硫代硫酸钠能够与水中的重金属离子络合,达到处理铁锈水的目的,在养殖水体中应用得较为广泛。

总而言之,上述”水锈”、”红水”等异常水质,要避免发生就须在平时注意和增强水质调控能力,科学施肥,常加新水,常开增氧机,泼洒生石灰中和水质,调节水中生物构成,恰当使用微生物制剂,保持肥活嫩爽状态,促成藻相均衡,从根源解决水质生”锈”等现象。有时池塘因乱用乱投药物或制剂引起整个生物、生态系统紊乱,必须泼洒生石灰水重塑生态系统,才能达到水质良好从而增加产量提高收益。

(刘文俊 2019.08.30)

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